Thuật ngữ PCR là viết tắt của ” Polymerase-Chain-Reaction “, đây là một phản ứng nhân bản DNA dựa trên những chu kỳ luân hồi nhiệt. Bài viết này nhằm mục đích trình làng những thông tin quan trọng về kỹ thuật PCR cũng như những yếu tố thường gặp khi sử dụng kỹ thuật này .
KỸ THUẬT PCR LÀ GÌ?
Thuật ngữ PCR chỉ một phản ứng nhân bản DNA dựa trên những chu kỳ luân hồi nhiệt. Phản ứng diễn ra trong một ống nghiệm nhỏ chứa dung dịch phản ứng ( gọi là PCR mix ). Trong PCR mix sẽ chứa những thành phần :
-
1) Polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase), enzyme này có nhiệt độ hoạt động tối ưu ở 72 oC.
-
2) 4 loại nucleotide (dNTP) gồm: dATP/dTTP/dGTP/dCTP là nguyên liệu để tổng hợp ra các bản sao DNA.
-
3) DNA chứa trình tự mục tiêu (Template): Thông thường trong xét nghiệm thì đây là DNA thu nhận từ mẫu cần xét nghiệm.
-
4) Cặp mồi đặc hiệu (Primer): Đây là các đoạn oligo-nucleotide dài khoảng 20 nucleotide và bắt cặp bổ sung đặc hiệu cho 2 đầu trình tự mục tiêu cần nhân bản.
-
5) Cation Mg2+ (MgCl2): đây là co-factor quan trọng để Taq polymerase hoạt động hiệu quả.
-
6) Dung dịch đệm Tris-KCl (PCR Buffer): Cung cấp môi trường thuận lợi cho phản ứng nhân bản diễn ra.
Ống nghiệm chứa PCR mix sẽ được đặt vào trong buồng ủ của máy luân nhiệt ( Thermo cycler ), ở Nước Ta thì thường gọi luôn là máy PCR. Nhiệt độ bên trong buồng ủ của máy PCR sẽ biến hóa theo chu kỳ luân hồi, nhờ đó mà quy trình nhân bản DNA được diễn ra ( xem video ) .
NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG CỦA PCR
Một chu kỳ luân hồi nhiệt của PCR sẽ gồm 3 quy trình tiến độ nhiệt độ ( Hình 1 ) :
-
1 – Giai đoạn biến tính: Nhiệt độ sẽ được đưa lên 94 oC, các liên kết hydro sẽ bị phá vỡ khiến DNA bị biến tính trở thành dạng mạch đơn.
-
2 – Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ được hạ xuống 55 – 65 oC, các đoạn mồi sẽ bắt cặp bổ sung vào 2 đầu trình tự mục tiêu.
-
3 – Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ được đưa lên 72 oC, Taq polymerase sẽ sử dụng dNTP để kéo dài đầu 3′ của mồi và tạo ra mạch bổ sung.
Như vậy, cứ qua một chu kỳ luân hồi nhiệt, số mạch DNA sẽ được nhân đôi. Nếu chu kỳ luân hồi nhiệt tái diễn liên tục 30 – 40 lần thì số bản sao sẽ là 230 ~ 240 bản sao. Số lượng bản sao DNA khổng lồ này khi được gắn những phân tử phát tín hiệu ( ví dụ Ethidium Bromide ) hoàn toàn có thể nhìn thấy bằng mắt thường trên gel điện di dưới ánh đèn UV ( Hình 2 ) .
VẤN ĐỀ NGOẠI NHIỄM SẢN PHẨM PCR
Nguyên lý của PCR là khuếch đại DNA, thế cho nên những phòng thí nghiệm sử dụng PCR liên tục không sớm thì muộn cũng sẽ bị nhiễm mẫu sản phẩm PCR lên tổng thể những thiết bị, dụng cụ, hóa chất. Người làm thí nghiệm sẽ nhận ra được thảm họa này khi hàng loạt những lần chạy PCR đều ra dương thế, kể cả khi sử dụng mẫu là nước cất. Khi điều này xảy ra thì chỉ có cách bỏ hàng loạt hóa chất, khử nhiễm hàng loạt phòng thí nghiệm …. Dù vậy điều này vẫn sẽ tái diễn sau một khoảng chừng thời hạn sử dụng PCR .
Nhiễm loại sản phẩm PCR từng là thử thách so với những phòng thí nghiệm sinh học phân tử. Tuy nhiên, lúc bấy giờ những nhà khoa học đã hoàn toàn có thể xử lý yếu tố này một cách khá hữu hiệu ( Hình 3 ), đó là trong thành phần dNTP có bổ trợ thêm một chút ít dUTP. Các mẫu sản phẩm PCR tạo ra sẽ luôn sống sót một số ít vị trí là U thay vì T, những vị trí U này sẽ hoàn toàn có thể giải quyết và xử lý phân hủy bằng enzme UNG. Mẫu DNA thu nhận từ mẫu thật ( template ) sẽ không chứa U, thế cho nên ủ PCR mix với enzyme UNG trước khi PCR sẽ giúp phân cắt hàng loạt những DNA ngoại nhiễm mà không tác động ảnh hưởng đến template .
CÁC KỸ THUẬT PCR THƯỜNG GẶP TRONG XÉT NGHIỆM
1) PCR đơn mồi (Simplex PCR): Đây là kiểu PCR cổ điển nhất, sử dụng 1 cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại 1 đoạn trình tự mục tiêu duy nhất.
2) PCR đa mồi (Multiplex PCR): Đây là kiểu PCR sử dụng nhiều cặp mồi khác nhau để khuếch đại các trình tự mục tiêu khác nhau trong cùng 1 mix phản ứng. Để thiết kế được phản ứng Multiplex PCR đòi hỏi các cặp mồi sử dụng phải có cùng nhiệt độ bắt cặp và các cặp mồi này cũng không được bắt cặp với nhau hay bắt cặp chéo lẫn nhau. Ngoài ra, cũng phải đảm bảo độ nhạy Multiplex PCR tương đương với Simplex PCR, điều này rất khó xảy ra nên thông thường multiplex PCR được sử dụng ở các tế bào nuôi cấy vì lúc này số lượng trình tự đích đủ lớn sẽ không đòi hỏi quá khắt khe về độ nhạy.
3) PCR tổ (Nested PCR): Sử dụng 2 cặp mồi, cặp mồi bên ngoài (outer primer) và cặp mồi bên trong (nested primer). Cặp mồi bên ngoài sẽ tham gia PCR lần 1 trước để làm tăng số lượng DNA chứa trình tự đích, kế đến là cặp mồi bên trong sẽ tham gia PCR lần 2 để phát hiện trình tự đích (Hình 4). Kỹ thuật này sử dụng khi cặp mồi đặc hiệu cho trình tự đích (nested primer) có độ nhạy kém.
4) RT-PCR: Là quy trình sử dụng khi trình tự đích là RNA, lúc này cần một bước sử dụng enzyme reverse transcriptase để chuyển RNA thành cDNA trước khi PCR, giai đoạn này gọi là giai đoạn RT. Kỹ thuật RT-PCR có 2 loại (Hình 5):
-
– RT-PCR 2 bước: Bước ủ RT thực hiện ở 1 ống nghiệm riêng, cDNA tạo thành sẽ được chuyển vào ống nghiệm chứa PCR mix để thực hiện PCR.
-
– RT-PCR 1 bước: Cả 2 bước RT và PCR đều thực hiện trong 1 ống nghiệm duy nhất, mix ban đầu sẽ chứa cả các thành phần cho RT lẫn cho PCR.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Phạm Hùng Vân. PCR và real-time PCR : Các yếu tố cơ bản và những ứng dụng thường gặp .
