Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản rất đầy đủ của tài liệu tại đây ( 3.02 MB, 92 trang )
Đồ án tốt nghiệp
GVHD: CN.Đỗ Thị Tuyến
Khoai tây
200g
Glucose
20g
Agar
20g
Nước cất
1000ml
pH
6.5
Tiến hành pha môi trường PGA và cách cấy nấm mốc
Khoai tây sau khi gọt vỏ, rửa sạch, cắt lát đem đi nấu với nước cất trong 30ph sau
đó lọc chiết lấy nước. Cho agar vào nấu, trong quá trình nấu khuấy đều. Cho glucose
vào và khuấy đều.
Cho môi trường vào ¼ các ống nghiệm, sau đó đem khử trùng ở 121oC, 1 atm trong
20 phút sau đó đem làm thạch nghiêng.
Tiến hành cấy chuyền từ ống nghiệm này qua ống nghiệm khác
Sau khi làm thạch nghiêng xong ta dùng que cấy vòng đã được thanh trùng trên đèn
cồn.
Sau đó đốt nóng miệng của 2 ống nghiệm trên đèn cồn.
Đưa que cấy vào ống canh trường và lấy một ít canh trường VSV rồi đưa đầu que
cấy vào tận đáy ống mơi trường.
Nhẹ nhàng hòa giọt canh trường VSV vào giọt nước ngưng tụ ở đáy.
Nhẹ nhàng và từ từ kéo đầu que cấy lên trên mặt thạch từ đáy lên trên theo kiểu
đường ziczắt.
Rút que cấy ra, đốt miệng ống nghiệm và nút bông rồi đậy lại.
SVTH: Nguyễn Quốc Đạt
Trang 42
Đồ án tốt nghiệp
GVHD: CN.Đỗ Thị Tuyến
Để các ống nghiệm vào giá, đốt que cấy trên đèn cồn rồi để vào chỗ cũ.
Tiến hành cấy truyền nấm mốc của Viện cung cấp sang ống nghiệm chứa môi
trường PGA.
Tất cả các thao tác đều được thực hiện trong buồng cấy vô trùng.
Môi trường dùng để nuôi cấy nấm sợi Asp. Kawasaki sinh tổng hợp GA:
Bột bắp và cám mì được trộn theo tỷ lệ thích hợp.
Dung dịch dinh dưỡng dựa theo mơi trường Mandel có thành phần (%):
–
(NH4)2SO4 0,14
–
KH2PO4 0,2
–
Ure 0,03
–
Peptone 0,075
–
CaCl2 0,03
–
MgSO4 .H2O 0,03
Và 10ml dung dịch khoáng vi lượng có nồng độ:
–
FeSO4 .7H2O 1,275(g/l)
–
ZnSO4 0,415(g/l)
–
CoCl2 0,5(g/l)
–
MnSO4. 1H2O 0,465 (g/l)
Tiến hành pha riêng từng loại hóa chất có trong thành phần của mơi trường Mandel
dưới dạng các dung dịch mẹ, hút chính xác thể tích từng loại dung dịch mẹ để đạt từng
SVTH: Nguyễn Quốc Đạt
Trang 43
Đồ án tốt nghiệp
GVHD: CN.Đỗ Thị Tuyến
loại phần trăm bằng với nồng độ có trong mơi trường Mandel, nồng độ này được gọi là
nồng đô x1 (lần1). Tiếp tục hút từng loại dung dịch với thể tích gấp 2,3 … đến 8 lần
thể tích ở nồng độ x1 để đạt các nồng độ x2, x3, x4, x5, x6, x7, x8 tương ứng với nồng
độ gấp 2, 3, 4, 5, 6, 7 và 8 so với nồng độ của môi trường Mandel.
Mơi trường Czapeck (bổ sung khống cho mơi trường lên men bán rắn)
SVTH: Nguyễn Quốc Đạt
NaNO3
3,5g
K2HPO4
1,5g
MgSO4.7H2O
0,5g
KCl
0,5g
FeSO4
0,01g
Saccaroza
30g
Nước
1000ml
Trang 44
Đồ án tốt nghiệp
GVHD: CN.Đỗ Thị Tuyến
2.3.2 Phương pháp xác định hàm lượng protein
Phương pháp Bradford
Bradford là một trong những phương pháp để xác định hàm lượng protein. Phương
pháp này có một số ưu điểm như sau:
–
Dễ sử dụng (chỉ cần một loại thuốc thử)
–
Độ nhạy cao (có thể phát hiện protein ở 1 – 20μg)
–
Phức chất giữa thuốc nhuộm và protein tương đối ổn định
–
Phương pháp này ít bị cản trở bởi các hóa chất sử dụng trong nghiên
cứu protein.
2.3.2.1 Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại và sự thay đổi
màu xảy ra khi Coomasie Brilliant Blue liên kết với protein trong dung dịch acid.
Trong dung dịch mang tính acid, khi khơng kết nối với protein thì thuốc nhuộm có
bước sóng cực đại ở 465nm. Khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu bước
sóng cực đại ở 595nm. Độ hấp thu ở bước sóng 595nm liên hệ trực tiếp với nồng độ
protein.
2.3.2.2 Hóa chất và thiết bị
Dung dịch mẫu protein cụ thể trong bài này là mẫu enzyme α–amylase cần xác
định.
Dung dịch albumin chuẩn (0.1 mg/ml): cân chính xác 10mg albumin, thêm 50ml
nước cất khuấy tan albumin. Cho toàn bộ dung dịch trên vào bình định mức 100 dẫn
nước tới vạch → dung dịch albumin chuẩn có nồng độ 0.1 mg/ml. Giữ ở –200C.
Dung dịch thuốc thử Bradford: có thành phần trong 100ml như sau:
–
Coomasie Brilliant Blue (CBB) 0.001g
SVTH: Nguyễn Quốc Đạt
Trang 45
Đồ án tốt nghiệp
GVHD: CN.Đỗ Thị Tuyến
–
Ethanol tuyệt đối 4.7g
–
Acid phosphoric 85%: 8.5g
Phẩm màu CBB được làm tan trong ethanol trong một chai đựng màu tối có nắp.
Bổ sung acid phosphoric và chỉnh tới 100ml bằng nước cất. Lắc đều. Bảo quản ở 40C.
Thiết bị máy quang phổ UV – Vis.
2.3.2.3 Lập đường chuẩn
Chuẩn bị các ống đánh số từ 0 đến 10
Bảng 2.1 – Bảng số liệu dựng đường chuẩn albumin
Ống nghiệm
Đối
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
chứng
Dung dịch albumin
0.1mg/ml (ml)
Nước cất (ml)
Thuốc thử Bradford
(ml)
Lắc đều các ống nghiệm, đo mật độ quang ở bước sóng 595nm. Ghi lại giá trị OD.
Trị số mật độ quang (OD) của các ống thử (1 – 10) sau khi trừ đi trị số của ống đối
chứng (ống 0) sẽ xây dựng được đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang
(OD) theo nồng độ protein.
SVTH: Nguyễn Quốc Đạt
Trang 46
Đồ án tốt nghiệp
GVHD: CN.Đỗ Thị Tuyến
Xác định nồng độ enzyme của mẫu:
Dịch chiết enzyme thô của nấm mốc trên cũng được tiến hành tương tự như trên.
Mẫu được pha loãng sao cho trị số mật độ quang đo được trong khoảng đường chuẩn.
Mật độ quang của mẫu cũng trừ đi trị số mật độ quang của ống đối chứng, rồi chiếu
vào đường chuẩn để suy ra lượng protein có trong dung dịch mẫu thí nghiệm.
2.3.3 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme GA theo Miller (1959)
2.3.3.1 Nguyên tắc
Dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử và thuốc thử acid dinitróalicylic
(DNS). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong
một phạm vi nhất định.
Sản phẩm thủy phân từ tinh bột dưới tác dụng của enzyme GA, thuốc thử DNS có
màu vàng trong dung dịch kiềm sẽ bị khử thành dung dịch có màu đỏ cam. Bằng cách
đo độ hấp thụ của dung dịch chứa tinh bột và enzyme GA trước và sau thủy phân sẽ
xác định được lượng đường khử tạo thành.
2.3.3.2 Hóa chất pha thuốc thử DNS
Nước cất: 1000ml
NaOH: 160g
K, Na tartrate: 300g
Acid 3 – 5 – dinitrosalicylic: 10g
Dung dịch hồ tinh bột 1% pha trong đệm acetate.
Mục đích: sử dụng làm cơ chất để hoạt tính enzyme GA trong các thí nghiệm tìm ra
các điều kiện tối ưu hóa mơi trường ni cấy.
SVTH: Nguyễn Quốc Đạt
Trang 47
Đồ án tốt nghiệp
GVHD: CN.Đỗ Thị Tuyến
2.3.3.3 Cách tiến hành
Lấy các ống nghiệm mỗi ống 2ml thuốc thử DNS.
Pha loãng dịch enzyme thu được ở nồng độ thích hợp.
Lấy mẫu trước thủy phân: cho 1ml dịch enzyme ở độ pha lỗng thích hợp vào các
ống nghiệm có chứa 2ml DNS rồi đem đun sơi trong 15 phút.
Làm mẫu thí nghiệm: cho 1ml dịch enzyme ở độ pha lỗng thích hợp vào các ống
nghiệm có sẵn 4ml hồ tinh bột 1% sau đó đem ủ 45oC trong 10phút. Sau khi ủ xong hút
ra 1 ml cho vào các ống nghiệm có chứa sẵn 2ml DNS rồi đun sôi trong 15 phút.
Làm mẫu đối chứng: cho 1ml nước cất đó vào các ống nghiệm chứa sẵn 2 ml DNS
rồi đun sôi trong 15phút.
Các mẫu thí nghiệm trên được xác định mật độ quang ở bước sóng 540 nm. Dựa
vào đường chuẩn glucose xác định được lượng đường khử thủy phân bởi enzyme GA.
2.3.3.4 Dựng đường chuẩn glucose
Cân chính xác 100mg đường glucose hòa tan khoảng 50 – 60ml nước cất.
Hòa tan hồn toàn cho vào định mức 100ml dẫn nước đến vạch.
Nồng độ đường glucose chuẩn là 1mg/ml.
Chuẩn bị 7 ống nghiệm đánh dấu từ 0 7.
SVTH: Nguyễn Quốc Đạt
Trang 48
Đồ án tốt nghiệp
GVHD: CN.Đỗ Thị Tuyến
Bảng 2.2: Bảng số liệu dựng đường chuẩn glucose
Ống số
0
1
2
3
4
5
6
7
Nồng độ glucose(mg/ml)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Glucose chuẩn 1mg/ml (ml)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Nước cất(ml)
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
Dung dịch DNS
2
2
2
2
2
2
2
2
Lắc đều các ống nghiệm, đun sôi trong 15phút.
Làm nguội đo mật độ quang ở bước sóng 540
Hoạt tính enzyme GA
Định nghĩa đơn vị hoạt tính: đơn vị hoạt tính của enzyme được tính theo đơn vị
quốc tế là UI. Mỗi UI là hoạt động của enzyme xúc tác chỉ thị sự chuyển hóa 1µmol cơ
chất sau 1 phút ở điều kiện thích hợp nhất.
Hoạt tính của enzyme GA: hoạt tính của enzyme GA được biểu hiện bằng số mg
glucose giải phóng từ tinh bột trong thời gian 1 phút, trong điều kiện thí nghiệm bởi
enzyme.
Hoạt tính enzyme GA trên 1ml dịch lọc
HT
SVTH: Nguyễn Quốc Đạt
Cn
(UI / ml )
tm
Trang 49
Đồ án tốt nghiệp
GVHD: CN.Đỗ Thị Tuyến
Trong đó:
C: lượng glucose giải phóng được xác định dựa vào đường chuẩn (mg/ml)
n: là hệ số pha loãng
m: khối lượng tinh bột đem thủy phân
t: thời gian phản ứng
Hoạt tính GA tính theo gam canh trường
HT
HT (UI / ml ) V
M
HT(UI/ml): đơn vị hoạt tính enzyme trong một ml dịch lọc.
V: thể tích dịch chiết enzyme sau lọc (ml)
M: khối lượng canh trường ban đầu đem trích ly (g)
SVTH: Nguyễn Quốc Đạt
Trang 50
Đồ án tốt nghiệp
GVHD: CN.Đỗ Thị Tuyến
2.4 Khảo sát tách chiết tinh sạch enzyme
Quy trình tách chiết tinh sạch enzyme
Sinh khối
Trích ly
Nước cất
Lọc, ly tâm
Thu dịch
Ủ lạnh 40C
Tủa enzyme
Cồn 960
Ly tâm lạnh
Enzyme hòa tan
Tinh
sạch
SVTH: Nguyễn Quốc Đạt
Enzyme
cố định
Trang 51
Đồ án tốt nghiệp
GVHD: CN.Đỗ Thị Tuyến
2.4.1 Khảo sát dung mơi trích ly
Quy trình chiết enzyme
Cân chế phẩm
H20
Muối
Đệm
Xác định hoạt tính
Xác định hàm lượng
Chọn dung mơi thích hợp
Giải thích quy trình
Tiến hành tách chiết enzyme bằng đệm acetate pH6, nước cất và muối sinh lý theo
bảng sau
Bảng 2.3 : Dung mơi trích ly enzyme
Dung mơi
Lượng canh trường(g)
Dung môi cho vào(ml)
H2 O
5
20
Đệm
5
20
Muối sinh lý
5
20
Khuấy đều hỗn hợp bằng máy khuấy.
Lọc hỗn hợp qua vải thơ.
Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút.
SVTH: Nguyễn Quốc Đạt
Trang 52
