Máy điện đi dùng để phát hiện và xác đinh AND trong tế bào vi sinh vật, thực vật và động vật hoang dã .
Gen là đơn vị chức năng di truyền cơ bản. Nó là một đoạn AND ( nhiều lúc ARN ) mã hóa thông tin cho việc tổng hợp loại sản phẩm sinh học xác lập ( hầu hết là protein ). Những nghiên cứu và điều tra tân tiến về cấu trúc và công dụng của nguyên sinh chất đã mở ra những hiểu biết mới về cấu trúc và tính năng của tế bào .
Cấu trúc AND cho phép lý giải tại sao lại có năng lực tang trữ và di truyền thông tin từ thế hệ này sang thế hệ khác một cách không thay đổi và bằng cách nào nó thông tin di truyền ở dạng thứ tự sắp xếp những gốc nucleotit lại chuyển hóa thành phân tử protein công dụng. Nội dung nêu trên tương quan đến giáo lý TT của di truyền phân tử gồm 3 điểm chính : sao chép thông tin di truyền từ AND cha mẹ sang AND con cháu, quy đổi mã di truyền từ AND sang ARN – quy trình phiên mã ( transcription ) và dịch mã di truyền ( transcription ) – thông tin di truyền từ mARN được chuyển sang trình tự sắp xếp đặc hiệu của axit amin trong phân tử protein .
Công nghệ AND tái tổ hợp – hiện là nền tảng cho sự phát triển như vũ bão của ngành công nghệ sinh học hiện đại.
Các giải pháp nghiên cứu và phân tích và tổng hợp tân tiến là tách DNA, xác lập thứ tự, tổng hợp, gắn xen nó vào vị trí nhất định bên trong sợi AND khác để nhân lên, và rồi lại tách ra .
Hiện nay trọn vẹn hoàn toàn có thể phân biệt đúng mực những đoạn AND đặc hiệu qua chẩn đoán những bệnh đặc biệt quan trọng. Đối với những bệnh khi những gel chưa được xác lập thì việc chuẩn đoán kém đúng mực .
Một bộ dò tìm đơn thuần chỉ là một khúc ADN hoặc ARN hoàn toàn có thể tìm khúc bổ trợ với nó bằng cách lai ( hybridization ). Có thể phát hiện sự bắt cặp này bằng nhiều cách, nhưng thông dụng nhất là sử dụng giải pháp tự chụp phóng xạ với bộ dò tìm có 32 p ( hình 1.1 )
Việc lai bộ dò tìm AND với đoạn AND tách rời gọi là Southern được diễn đạt trên hình 1.1. Các đoạn ADN hình thành sau khi ADN bị endonucleaza restrictaza cắt sẽ được tách rời ra bằng giải pháp điện di trên gel agaroza. Khoảng cách vận động và di chuyển phụ thuộc vào vào size đoạn. Càng nhỏ càng chạy nhanh. Sau khi đã tách rời, người ra dùng kiềm để làm biến tính những đoạn đó và chuyển chúng lên màng nyclon. Tấm màng này được ủ với dung dịch có chất dò tìm phóng xa, nó chỉ lai với những đoạn AND nào chứa thứ tự bổ trợ .
Việc xác lập thứ tự ARN ( ví dụ mARN ) cũng hoàn toàn có thể theo trình tự bằng cách điện di ARN trên gel, chuyển lên màng nylon và cho lai với AND probe đặc hiệu .
Phương pháp này gọi là Northern Blotting .
Hình 1.1. Lai bộ dò tìm với đoạn AND, tách ra bằng điện di và chuyển sang tấm nylon (Southern blotting)
1.2. CẤU TRÚC CỦA MÁY ĐIỆN DI
Máy điện di gồm 3 bộ phận cơ bản : khay quản lý và vận hành ( hình 1.2 ), nắp có điện thế cao và buồng giảm xốc .
Khay quản lý và vận hành gồm có khuôn đúc gel. Khay di động trong suốt và bọt đêm bằng caosu .
Hình 1.2. Khay vận hành
Chuẩn bị khuôn gel như sau : lót miếng bọt đệm vào đáy khay di động và sau đó ấn mạnh miếng đệm vào cạnh khay ( ép cho đáy khay di động lọt trọn vẹn vào khay khuôn trước khi hàn kín vào miếng bọt
Trên nắp có đầu ra của mã màu, được nối với nguồn điện qua điện cực trên đế máy ( hình 1.3 ). Buống giảm sốc có ống nối điện cực, bục chuyển dời và lỗ nạp etylen glycol / nước với tỷ suất 50/50 ( hình 1.4 )
Hình 1.3. Nắp có điện thế cao
Hình 1.4. Buồng giảm xốc
1.3. CẤU TRÚC VẬN HÀNH
1.3.1. ChuẨN bị dung dịch
Chuẩn bị 250 ml dung dịch đệm. Hai dung dịch đệm được sử dụng phổ cập cho điện di AND được chuẩn bị sẵn sàng theo công thức pha chế dưới đây .
Mẫu đệm thử
Dung dịch mẫu
( 5X ; 25 % ficoll 400 ; 25 % phenol bromua xanh ; 10 ml )
Nước đã được khử ion hóa : 7.0 ml
Ficoll 400 : 2.5 mg
Phenol bromua xanh ( F 691.9 ) : 25.0 mg
Nước đã được khử ion hóa : 10.0 ml
Chú ý 1 : Sucrora và glyxerol hoàn toàn có thể sử dụng để thay thế sửa chữa cho ficoll 400 .
Chú ý 2 : Xylen cyanol ( 0.25 % ) mà chuyển dời chậm hơn phenol bromua xanh, thì hoàn toàn có thể tăng thêm một lượng nếu mong ước, sự cô cạn dung dịch agarora được xác lập khi thêm vào có tương quan đến polynucleotit .
Thể tích bể
Bảng 1.1. Những loại lược
Chuẩn bị khoảng chừng 7 ml dung dịch agaroza ứng với mỗi mililit chiều dày gel ( vd : 1 get 3 mm cần 0.3 x7x10 = 21 ml )
Hòa tan agaroza trong dung dịch đệm, kiểm soát và điều chỉnh nhiệt độ hỗn hợp. Cho phép làm mát dung dịch đến 50 oC trước khi rót vào khuôn .
Để quan sát sự phân ly trong hiện tượng kỳ lạ điện chuyển thương thêm 0.5 mg / ml etydi bromua vào dung dịch gel .
1.3.2. Đúc gel
Thiết bị đặt khay di động : Một tay giữ chặt khuôn đúc, tay kia đặt đầu khay di động áp vào miệng bọt đệm và sau đó hạ thấp rồi đặt lên đoạn cuối của khuôn đúc. Đặt đầu còn lại của khay áp sát vào miệng bọt đệm .
Chuẩn bị lược : Lắp hai rãnh trong lược vào giữa những đầu ốc và mặt sau lược. Siết chặt ốc. Đặt lược vào mép khuôn và chỉnh phần cuối của lược để cách khay di động khoảng chừng 1 mm. Siết chặt ốc để giữ chắc lược .
Di chuyển lược : Đặt khuôn lắp ráp lên mặt phẳng nằm ngang. Đặt ống nivo lên khay di động, nó như thiết bị kiểm tra xem khuôn có đúng vị trí nằm ngang không .
Hình 1.5. Mặt sau lược, lắp trên vành của khuôn đúc, vị trí lược tron gel. Hai ốc hiệu lược chỉnh.
Để tạo hai rãnh, đặt lược thứ hai vào giữa gel
Đổ dung dịch agaroza được làm lạnh đến 50 oC vào khuôn đúc. Định hướng lược để những mặt phẳng lược gần miếng đệm bọt nhất và đặt nó lên cạnh khay. Lược luôn luôn ở vào vị trí thẳng đứng để tránh sự vặn vẹo hình dạng. Để chạy lượng mẫu gấp 2 lần, đặt lược thứ hai vào chính giữa khay. Cho phép thời hạn tối thiểu để gel đặc lại là 30 phút .
Khi gel đã kết lại, lần lượt tháo lược cẩn trọng. Nhấc một phần và nghiêng nhẹ một đầu của lược, sau đó rút từ từ ra khỏi gel ( kéo thẳng lược, tạo ra một khoảng chừng không để hoàn toàn có thể nhấc gel ra khỏi khay )
Tháo khay di động và gel bằng cách nắm lấy tau cầm của khay, ấn đầu áp vào miếng bọt đệm. Khi khay
đã đã sạch đêm thì nhấc ra. Chuyển khay và gel tới chỗ mát .
1.3.3. Vận hành điện di
1. Làm lạnh nền trước khi thực thi. Đặc biệt khi dùng điện áp cao hơn hoặc sự phân ly lao lý là trên 30 phút .
Chú ý : Để thực thi phân ly, hoặc là thêm 0.5 mg / ml etydi bromua vào dung dịch đêm hoặc thêm 50 mg / ml etydi bromua vào bộ đệm mẫu. Để quan sát, hay cắt điện, tháo phần nắp và giữ đền cực tím gần gel .
Thêm từ từ etydi bromua vào dung dịch đệm hay đệm mẫu. Phát hiện bằng giải pháp này không nhạy bằng cách nhuộm màu và nhìn qua thiết bị soi .
2. Đổ dung dịch vào những khoang sao cho đến khi đệm cao hơn gel khoảng chừng 1 mm ( khoảng chừng 220 ml )
3. Nạp mẫu. Thêm mãu vào 5X bộ đệm tải mẫu và trộn ( 1/5 thể tích là đệm nạp vào ). Sử dụng micropipette để nạp mẫu, chú ý quan tâm tránh đâm thủng hoặc tạo nên nhiều khủng hoảng bong bóng .
4. Đặt nắp để catot ( -, dây đen ) ở đoạn cuối gần mẫu nhất, ( Mẫu axit nucleic vận động và di chuyển về phía anot, +, dây đỏ ). Nối những dây màu ( đỏ với đỏ, đen với đen ) tới những nguồn điện, như thể R = ESP 2A200. Đặt mức điện áp và thiết bị bấm giờ ( nếu có sẵn ) theo mức độ phân ly .
Nhanh, điện áp cao
Những ứng dung nào đó, như thể kiểm tra những mẫu, hoàn toàn có thể thực thi nhanh dưới điều kiện kèm theo điện áp cao. Làm lạnh ( – 20 oC ) và số lượng giới hạn thời hạn quản lý và vận hành 5 ph út hoặc ít hơn ở điện áp 500V .
Chậm hơn, điện áp cao hơn
Một gradient điện áp 12V / cm ( 150V ) trong 30 ÷ 40 phút ( sử dụng dung dịch đệm 1 % gel agaroza vài 0,5 X TBE ) cắt Hind III của lamda ADN thành những đoạn0, 1 ÷ 23 kb. Hoặc dùng dung dịch như vật, mãu này hoàn toàn có thể chạy ở 24 V / cm ( 300V ) thì hoàn toàn có thể phân cắt trong 20 ÷ 30 phuït. Làm lạnh thiết bị trước khi triển khai .
Chú ý :
Nếu khổng đổ thêm màu vào chất lỏng làm nguội thì đặt trên nền tối để quan sát thuận tiện hơn .
Đặt thiết bị còn nóng lên nền được làm lạnh cso thể ảnh hượng đến nhiệt độ xung quanh. Nếu sự quá nhiệt không được trấn áp, gel sẽ tan hoặc thiết bị sẽ cong .
Etydi bromua là chất ăn da mạnh, nên cần mang bao tay
Đeo kính chắn tia UV và bảo vệ da khi sử dụng đèn UV
Tính gradient điện áp, chia điện áp đặt vào cho khoảng cách giữa những cực 12.7 cm .
Bảng 1.2. Điện áp đặt vào và thời gian đề nghị
Ghi chú: (1) để thời gian chạy ít hơn hoặc bằng 20 phút, sử dụng 0,5X TBE và làm lạnh nền đến −200C trước khi sử dụng.
Sau khi phân ly
1 – Ngắt điện, tháo dây dẫn, tháo nắp .
2 – Nếu không thêm etydi bromua vào gel hoặc mẫu trước khi chạy, nhuộm gel trong dung dịch 0.5 : 1 g / ml etydi bromua trong nước hoặc đêm .
3 – Làm sạch thiết bị
Vận hành
Các loại gel agaroza được chuẩn bị sẵn sàng lần đầu trong khuôn đúc gel. Những mẫu được nạp vào trong những bể chứa và được phân ly. Thuốc nhuộm huỳnh quang hoàn toàn có thể được thêm vào chất đệm điện di hoặc gel hoặc cả hai để tìm ra tín hiệu của quy trình phân ly. Sau khi điện di, gel hoàn toàn có thể cho màu, ghi lại màu, thấm màu thêm hoặc sấy tự động hóa .
Đổ đầy lỗ với chất tải lạnh. Dù không làm lạnh đi nữa thì điều quan trọng là phải đổ đầy lỗ với dung dịch làm lạnh đặc trưng trước khi sử dụng vì dung dịch cung ứng nguồn nhiệt thiết yếu .
Chuẩn bị 600 ml với 50/50 2H2 ( OH ) 2 / H2O
Để giúp xem những bể chứa được rõ ràng hơn trong khi nạp mẫu, thêm 1 hoặc 2 giọt thuốc nhuộm hòa tan hoặc màu thực phẩm vào dung dịch làm lạnh .
Tìm ra hai lỗ hỏng nạp nước ở phần trên của lỗ. Đổ đầy lõ hỏng đến mức hoàn toàn có thể như chất làm lạnh bằng ống phun hoặc máy bơm với 50 ml
Bấm nút caosu màu nâu vào mỗi lỗ .
Sắp xếp dung dịch đã sẵn sàng chuẩn bị trong thùng đá hoặc bên trong máy lạnh hoặc tủ lạnh để không dưới 20 oC trong khoảng chừng 1 giờ trước khi sử dụng ( hóa chất được dự trong phòng hay tủ lạnh )
Chú ý :
Không đổ đầy lỗ với chất chống đông thương mại, dung môi hữu cơ hoặc nước cất .
Không thiết yếu sửa chữa thay thế chất làm lạnh
1.3.4 Tính kết quả
Hiện tượng điện di chất gel hoàn toàn có thể sử dụng những mảnh nhỏ AND khoảng chừng 0.1 kb hay nhỏ hơn loại el polyacrylamit thường sử dụng những mảnh nhỏ hơn 1 kb .
Tính điện di của AND. Nồng độ agaroza pháp luật cho quy trình phân ly thành những mảnh vỡ với những size khác nhau được cho trong bảng 1.3
Bảng 1.3. Nồng độ để điện di của các mảnh vỡ AND đối với các loại chất khác
Những tác nhân tác động ảnh hưởng đến hiệu quả quy trình phân ly gồm có : chất đệm, điện áp đặt vào, nhiệt độ, cấu trúc và sự xuất hiện của etydi bromua, những agaroza đặc biệt quan trọng có sẵn .
Tiêu chuẩn chung cho đoạn Hind III phage λ. Loại cho 8 mảnh vỡ sắp xếp trong khoảng chừng từ 0.1 đến 23 kb cho mỗi cặp 2 sợi .
Để phân giải tốt, chuyển dời trên đoạn 10 cm mất 45 phút 1 % gel agaroza trong gel 0,5 X TBE ở điện áp 150V .
Tính điện di của ARN
ARN hoàn toàn có thể phân loại dựa theo kích cỡ cơ bản. Để tránh ảnh hưởng tác động đến thời kỳ chuyển hóa cấu trúc ARN được biến tính trước hay suốt thời hạn điện di
VD : ARN đã biến tính trước với glyoxal và glyoxal sunfoxit hoàn toàn có thể gel agaroza độc lập, hay ARN hoàn toàn có thể Gel agaroza độc lập, hay ARN hoàn toàn có thể bị cắt phân đoạn. Gel agaroza chứa hydroxyt thủy ngân II metyl hay focmaldehyt .
1.3.3. Sự phát hiện AND
AND hoàn toàn có thể được phát hiện nhờ sự phát huỳnh quang của link etydi bromua ( C2H10BrN3 ) hay nhờ chiêu thức chụp ảnh bằng tia X của đồng vị phóng xa AND. Etydi bromua ( 0,5 µg / ml ) hoàn toàn có thể được thêm vào dung dịch đệm vận động và di chuyển, để quan sát sư dịch chuyển của mẫu, vì sự phát huỳnh quang của thuốc nhuộm dưới tính năng của tia cực tím sẽ được bộc lộ ở dạng dải ( để xác lập được sự đổi khác đó, tắt nguồn cung ứng nguồn năng lượng và quy đổi thành phần agaroza cũ ra nắp thiết bị định tia cực tím gần khay vẫn hành. Đặt nắp lại và bật đền để bắt lại sự điện di. Ngoài ra, sau khi điện di, gel biến màu trong dung dịch hòa tan ( edydi bromua 10,5 µg / ml H2O ) khoảng chừng từ 10 đến 60 phút rồi quan sát và chụp ảnh mẫu bằng giải pháp chiếu tia cực tím .
Để chụp ảnh gel, dùng chiêu thức chiếu tia cực tím trên mặt phẳng tại mỗi vị trí ở đĩa quản lý và vận hành hoặc chuyển dời nhẹ bản gel trên mặt phẳng sẽ quan sát được tối đa ( đĩa quản lý và vận hành có 95 % ánh sang trắng với bước sóng 254 mm và 40 % ánh sáng trắng với bước sóng 254 mm ). Quan sát mẫu bằng tia cực tím ở bước sóng 366 mm hoặc làm giảm cường độ tia cực tím xuống 302 mm để giảm sự phát huỳnh quang của etydi bromua không link, gel hoàn toàn có thể bị mất màu bởi sự hút ẩm của nó trong 5 phút với MgCl2 0.01 M hoặc trong 1 giờ với MgSO4 0.001 M. Sự mất màu đã tạo nên điều kiện kèm theo thuận tiện để phát hiện hàm lượng AND nhỏ .
1.3.6. Những chú ý quan tâm thiết yếu
Nắp bảo đảm an toàn phải được lắp trước khi nối nguồn điện với nguồn cung ứng nguồn năng lượng .
Tất cả những công tắc nguồn điện và ngắt nguồn phân phối điện trước khi tháo lắp bảo đảm an toàn .
Trước khi sử dụng lần đầu, làm đầy lỗ với 1 lượng 600 ml 50/50 etylen glycol / nước để ngăn ngừa sự tổn thất không hề hồi sinh cho thiết bị. Lỗ chứa lượng trên hoàn toàn có thể đổ đầy ngay cả khi không cần làm lạnh theo nhu yếu .
Không sử dụng nước cất, chất chống đông thương mại hoặc bất kể dung môi hữu cơ nào để đổ vào lỗ đó. Nước được lấy ra khi ngừng hoạt động. Nếu không nó bị hút vào bên trong dung dịch và phá vỡ link. Dung môi hữu cơ sẽ gây ra sự tổn thất hóa chất không hề phục sinh cho thiết bị .
Không làm lạnh lượng dung dịch cho vào lỗ dưới − 200C ( − 40F ). Có thể làm lạnh lượng dung dịch đó trong thùng đá, máy làm lạnh hoặc trong tủ lạnh .
Không kiểm soát và điều chỉnh nhiệt độ dung dịch đệm hoặc gel trên 50 oC. Ngăn chặn sự đun nóng quá nhiệt bằng cách làm lạnh lượng dung dịch đó trước khi sử dụng. Để ngăn ngừa sự đun nóng quá nhiệt trong quy trình lê dài chạy điện áp cao, thay thế sửa chữa lượng dung dịch thứ nhất bằng lương dung dịch thứ 2 đã được làm lạnh. Sự đun nóng quá nhiệt sẽ gây ra sự tổn thất không hề hồi sinh cho thiết bị
Làm sạch
Sau mỗi lần sử dụng, làm sạch thiết bị bằng chất tẩy nhẹ và nước, súc cẩn trọng vưới nước cất và làm khô bằng không khí. Không được đặt thiết bị vào dung dịch hoặc khí thơm hoặc những hydrocacbon halogen hóa, xeton, este, alcol * trên 30 % Hoặc axit đặc trên 25 %
Để tránh làm bẩn DNaza và ARNza, ngâm những khoang chứa đệm hoặc khuôn đúc khoảng chừng 10 phút trong dung dich h2o2 3 % sau đó súc cẩn trọng với DEPC được giải quyết và xử lý rồi cho vào nồi hấp ( dùng nước đã được ion hóa để hấp )
1.3.7. Điều chỉnh thiết bị điện di
Bể chắn mẫu. Để cho gel đặc lại tối thiểu là 30 phút và giữ ở nhiệt độ phòng trước khi tháo lược
Khi tháo lược giữ ở cạnh ngắn và nâng nhẹ để tránh gẫy gel
Giữ để không hỏng bể chứa, dung pipet để lấy mẫu, nỗ lực cho vào giữa hồ bơi và không làm thủng đáy bể
Mẫu thử không chạy dọc theo cột
Nếu chảy thành sợi trên khay bị hỏng thì phải thay thế sửa chữa
Giảm điện áp
Chọn chất đêm với nồng độ và hàm lượng dung dịch đêm thích hợp ( lượng dung dịch đệm TBE chứa nhiều hơn loại TAE )
Nếu chất đệm bị tháo ra hết thì ngưng hoạt động giải trí, tháo nắp, dùng ống hút lấy chất đệm từ lỗ khác cho vào bên trong lỗ đối lập đến khi đầy chất đệm
Nếu chất gel không giống hệt, đặt khuôn đúc nằm ngang trước khi đổ dồn gel ( để làm hòa lẫn vào nhau )
Cặp khuôn đúc
Lược phải đặt thẳng đứng để tránh làm biến dạng bể chứa ,
Giảm lớp đệm 1 mm từ mặt phẳng ở phía trên gel, giảm gradient nhiệt độ
Tái tạo gel không đủ chất lượng
Thêm ficoll, glyxerol hay đường ( mía ) vào nhiều dung dịch lấy mẫu để bảo vệ mẫu lắng xuống đáy bể ( chọn chất ficoll )
Chắc chắn mẫu thử được hòa tan trọn vẹn .
Giảm điện thế
Giảm nồng độ mẫu thử
Giảm thể tích mẫu
Cần tối thiểu 1 mm gel dưới đáy lược để tránh mẫu rỉ ra từ đáy bể
Giảm nồng độ muối trong mẫu thử
Kiểm tra độ enzim, mẫu thử hoàn toàn có thể cần ảnh hưởng tác động lâu ( xúc tác xảy ra quy trình ) và một loại chất đệm khác hạn chế sự vận động và di chuyển ,
Pha chế mẫu mới nếu hoài nghi mẫu bị nhiễm bẩn
Chọn loại agaroza với vận tốc thẩm thấy chậm
Đặt khay đúng vi trí không ân mạnh vào bên trong.
>> Xem lại : Thiết bị để nghiền, tiêu chuẩn hóa, tạo viền và tạo màng bao siêu mỏng dính
>> Xem tiếp : An toàn lao động và bảo vệ thiên nhiên và môi trường trong xí nghiệp sản xuất công nghiệp vi sinh
Sưu tầm và biên soạn bởi : Valve Men Team. / .
